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蛋白质和多肽的 MALDI 分析包括以下一系列步骤
(1) 被分析物与基质（小分子芳香化合物）混合。基质通常溶解在酸性有机溶剂中，以超过样品 1000 倍的量与样品混合，将样品和基质加到金属片／靶上，溶剂在空气中挥发后，形成了样品-基质共结晶．，
(2) 将加有样品-基质混合结晶的靶送入质谱仪的真空室 (10-5-10-8Torr) 。
(3) 在金属片／靶上加+ 20-30kV 的高电压（产生正离子），同时有短的激光脉冲照射在干燥的样品上。
(4) 基质晶体吸收特定波长的激光能量（紫外激光 337nm, 红外激光 2.94μm, 又以热的形式将能量释放 引发了解吸附这一迅速的放热过程又使基质品体升华，基质和样品分子气化进入质谱仪的气相。
(5) 通过在气相中发生质子化／去质子化，附着阳离子／脱离阳离子，或氧化／还原等过程实现离子化。产生的离子从靶表面（保持 +20-30kV 高电压）被推斥并加速进入一系列的离子透镜（保持接地电压），离子透镜聚焦离子进入飞行时间质量分析器的无场漂移区 (50-300cm) 贮检测器安装在无场漂移区末端，通过飞行管道的离子被检测器记录。
(6) MALDI 离子化过程送入质量分析器的离子实质上具有相间的终动能。在动能定时离子的速度与离子的质荷比m/z成反比。因此，线性检测器中，离子到达飞行管道另一端检测器的时间反映被检测离子的m/z。
(7) 离子通过无场漂移区的飞行时间由激光脉冲面向发检测器记录。因此，每一离子化过程 产生的每批离子到达检测器的飞行时间都被记录下，并被换为质荷比m/z。